Skip to content

chirurg ortopeda wrocław prywatnie cd

2 miesiące ago

510 words

Ponieważ ta procedura ekstrakcji aktywuje TGF., nie można było określić ilości aktywnego i nieaktywnego TGF. obecnego w próbkach. W celu ekstrakcji TGF. do wcześniej rozcieńczonej ml próbkę osocza dodano 4 ml roztworu kwas etanol (375 ml 95% etanolu, 7,5 ml 12 N kwasu chlorowodorowego, 33 mg fenylometylosulfanylopluorku i 1,9 mg pepstatyny). o współczynnik 2 z wodą destylowaną. Próbki inkubowano przez noc w 4 ° C, następnie odwirowywano przy 20000 xg przez 30 minut w 4 ° C. Supernatant usunięto i przechowywano w temperaturze 4 ° C, a pozostałą część próbki ponownie wyekstrahowano i odwirowano. Dwa supernatanty połączono następnie i pH doprowadzono do 5,2 do 5,3 za pomocą wodorotlenku amonu. Jeden mililitr 2 M wodorotlenku amonu dodano do 85 ml supernatantu i rozcieńczono 3 razy zimnym (4 ° C) 100% etanolem. Ten roztwór inkubowano w -20 ° C przez co najmniej dwa dni, a następnie odwirowano. Osad ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 4 ml M kwasu octowego, dializowano przez noc w 1% kwasie octowym, podzielono na porcje, liofilizowano i przechowywano w temperaturze -20 ° C. Test na TGF.
Poziom TGF. w osoczu oznaczono ilościowo za pomocą testu mierzącego hamowanie wzrostu komórek nabłonkowych norek-płuc39. Ponieważ test ten nie jest zdolny do rozróżnienia pomiędzy trzema izoformami TGF., w niniejszym dokumencie po prostu używamy terminu TGF.. W skrócie, po tym, jak komórki nabłonkowe MV Lu nabłonka płucnego (CCL-64) poddano trypsynizacji i zawieszone w pożywce do oznaczeń, wysiewano je w stężeniu 105 komórek na mililitr. Po inkubacji w 37 ° C przez godzinę do studzienek dodano próbki testowe TGF. i standardy o znanym stężeniu TGF.1 i inkubowano w 37 ° C przez 22 godziny. Stopień syntezy DNA określono następnie inkubując komórki z 3-znakowaną tymidyną w temperaturze 37 ° C przez dodatkowe cztery godziny. Komórki ostatecznie utrwalono przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w 1,0 ml roztworu kwasu metanol-octowego (3: obj./obj.) I przemyto dwa razy 80% metanolem. Następnie solubilizowano je w 0,3 N wodorotlenku sodu, a znakowany radioaktywnie DNA ekstrahowano przez strącanie kwasem trichlorooctowym. Ilość radioaktywności w komórkach eksponowanych na badane próbki i standardy TGF.1 określono za pomocą licznika scyntylacyjnego w cieczy. Test ten był w stanie wykryć ilości TGF. w zakresie od 0,05 do 0,5 ng na mililitr (0,2 do 2 x 10-8 mmol na litr), przy 50% zahamowaniu występującym w stężeniu 0,1 ng na mililitr (0,4 x 10-8 mmol za litr). Próbki rozcieńczano seryjnie, aż obecne ilości TGF. znajdowały się w liniowej części krzywej w kształcie esicy w odniesieniu do standardu TGF.. Rzeczywiste poziomy TGF. zostały następnie obliczone przez pomnożenie zmierzonego stężenia TGF. przez współczynnik rozcieńczenia. Badane próbki zawsze badano próbkami zawierającymi znane ilości TGF. w celu zapewnienia wiarygodności testu biologicznego.
Aby określić, czy działanie hamujące badanych próbek było spowodowane w szczególności TGF., neutralizujące przeciwciało, które rozpoznało TGF. (R & D Systems, Minneapolis) zostało dodane do wszystkich badanych próbek na godzinę przed dodaniem ich do komórek płuc norek
[hasła pokrewne: szpic miniaturowy allegro, internista pruszków, czynnik von willebranda ]

0 thoughts on “chirurg ortopeda wrocław prywatnie cd”